Câu 5 và 6: Khái niệm PCR, nguyên lý, thành phần của phản ứng PCR và ứng dụng

1. Khái niệm PCR:

PCR ( polymerase chain reaction ) là thử nghiệm nhân bản của một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt.

Mồi: là một đoạn olygonucleotide dài khoảng 20_30 bases và có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA đích. Mồi phải đặc hiệu, đặc trưng cho trình tự DNA đích, mỗi mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.

2. Nguyên tắc:

Một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

+ Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 940C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn. Giai đoạn này gọi là giai đoạn biến tính.

+ Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ sẽ được hạ xuống 550C_650C là nhiệt độ thích hợp để các mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.

+ Giai đoạn  kéo dài: nhiệt độ được đưa lên 720C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của E Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3 của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5 của sợi DNA đích để bắt đầu cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.

Như vậy qua một chu kỳ nhiệt một DNA đích được nhân bản thành 2 bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại n lần thì từ một DNA đích nhân bản thành 2n bản sao.

3. Thành phần của phản ứng PCR:

_ DNA đích

_ Mồi

_ Enzym Taq polymerase

_ dNTP

_ MgCl2

_ PCR buffer

* DNA đích: là đoạn DNA có trình tự đặc hiệu với tác nhân nhiễm trùng. DNA đích có vai trò làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung.

* Enzym Taq polymerase là E xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều từ 5’_3’

* dNTP gồm 4 loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP là nguyên liệu để tổng hợp sợi bổ sung. Nồng độ mỗi loại phải ở trạng thái cân bằng, nếu mất trạng thái cân bằng sẽ gây ra lỗi sao chép, nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả.

* MgCl2: có vai trò là cofactor cho hoạt động của E Taq polymerase. Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR:

Nồng độ cao có thể làm xuất hiện các sản  phẩm PCR không đặc hiệu.

Nồng độ thấp làm giảm lượng sản phẩm PCR.

* PCR buffer đóng vai trò là dung dịch đệm trong các tube phản ứng PCR.

4. Ứng dụng của phản ứng PCR:

_ Tạo số lượng lớn bản sao DNA: dòng hóa gen, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò...

_ Biến đổi một trình tự DNA: thêm vị trí của E cắt hạn chế, gây tạo đột biến trên DNA, thêm trình tự promoter, trình tự gắn của ribosom...

_ Chuẩn đoán phân tử: nghiên cứu mức độ nhiếm virus, vi khuẩn, để chuẩn đoán các bệnh viêm nhiễm.