Câu 4: Hãy nêu cơ chế xúc tác của enzym. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác của ez.

1. Cơ chế xúc tác của enzym

Những quan điểm hiện nay nhằm giải thích cơ chế tác dụng của enzyme đều cho rằng khi enzyme (E) tưong tác với cơ chất (S) sẽ làm giảm năng lựợng hoạt hóa các phản ứng hóa sinh. Muốn làm giảm năng lượng hoạt hóa các phản ứng enzyme cần trải qua nhiều giai đoạn trung gian và tạo thành phức chất nhất định giữa E và S.

Khi kết hợp với phân tử enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các mối liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng sẽ làm thay đổi động năng và thế năng nên phân tử cơ chất trở nên hoạt động và dễ dàng tham gia phản ứng.

Việc tạo thành phức hợp E-S giai đoạn đầu xảy ra rất nhanh và rất không bền. Do đó sau một thời gian dài mới được chứng minh bằng thực nghiệm. Bằng chứng rõ ràng nhất về sự tồn tại của phức hợp E-S là thành công của hai nhà hóa sinh Nhật Bản K. Iaglu và T. Ozava là tách được phức E-S trong phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa (loại trừ nhóm amine) một amino acid dãy D do oxydase xúc tác.

Nhìn chung ta có thể hình dung cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất tạo sản phẩm bằng phương trình tổng quát như sau:

E + S D E - S " P + E

Giai đoạn 1: E kết hợp với S để tạo thành E-S. Giai đoạn này xảy ra rất nhanh, nhờ các liên kết không bền như liên kết hydro, tương tác tĩnh diện, tương tác Van der Waals... Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.

Giai đoạn 2: Sau khi tạo phức E-S, cơ chất có những biến đổi nhất định về mật độ điện tử, cấu hình dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.

Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do.

Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có 2 hay nhiều lọai cơ chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng:

ATP + glucose hexokinase → ADP + glucose 6 phosphate

Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng 2 cơ chất có thể như sau:

a/ Cơ chế tạo phức 3 thành phần

b/ Cơ chế không tạo phức 3 thành phần

Đây là trường hợp cơ chất thứ 2 (S2) chỉ kết hợp vào enzyme (ở trạng thái E') sau khi P1 được tạo thành.

2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác của enzym

2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S], v= K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác.

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hoá thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.

Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất.

Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S].

Khi Km=[S] thì v =1/2 Vmax

(Km gọi là hằng số Michaelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme)

2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor)

Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn khả nâng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Kìm hãm enzyme có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau (thuận nghịch hay không thuận nghịch). Thuận nghịch có:

Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibition)

Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzyme. Chất kìm hãm chiếm chổ của cơ chất ở enzyme.

Kiểu kìm hãm cạnh tranh

Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn.

Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xẩy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có sự tương đồng về mặt hoá học. ví dụ: malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic acid thành acid fumaric acid.

Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm. Trường hợp này xẩy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và chiếm vị trí hoạt động ở phân tử enzyme.

Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự do.

Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh

Cách 3: Kìm hãm hỗn hợp (mixed inhibition)

Kiểu kìm hãm hỗn hợp

Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P.

Một trường hợp kìm hãm còn gặp nữa là kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là "kìm hãm cơ chất" như kìm hãm urease khi nồng độ ure cao, ngoài ra còn có các enzyme khác như lactatdehydrogenase, carboxypeptidase, lipase, pyrophotphatase, photphofructokinase (đối với ATP). Nguyên nhân của những hiện tượng này cón chưa được biết rõ. Đó có thể là:

+ Tồn tại nhiều trung tâm liên kết với cơ chất bằng các ái lực khác nhau. Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ liên kết với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó liên kết với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động.

+ Cơ chất cũng có thể được liên kết nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme. Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác còn có trung tâm điểu chỉnh.

+ Cơ chất có thể liên kết với một chất hoạt hoá và bằng cách này nó tách khỏi E.

+ Cơ chất có thể chiếm chỗ (ngăn cản) một cofactor (đồng yếu tố) hay một coenzyme.

+ Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó làm mất đi tình chuyên hoá của enzyme.

2.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamin tan trong nước.

Ví dụ: Mg++ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ.

2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant-Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần.

Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vô cơ thông thường.

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C, cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đăc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao.

2.6. Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme.Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng xúc tác. Đường biểu diễn có dạng như hình sau:

Ảnh hưởng của pH lên họat độ enzyme

Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:

a/ Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp.

b/ Ở hai sườn của pH tối ưu có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme.

c/ Làm thay đổi mức ion hoá hay phân ly cơ chất.

d/ Làm thay đổi mức ion hoá nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực đại.

Nhờ xác định Vmax và Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận định lại bản chất của các nhóm tham gia vào liên kết cơ chất và quá trình tự xúc tác.

2.7. Các yếu tố khác

+ Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất.

Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao. Ví dụ dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính.

+ Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh. Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme.

+ Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng.

Nhận xét chung: Độ bền phụ thuộc vào trang thái tồn tại của enzyme, càng tinh khiết thì enzyme càng kém bền, dịch càng loãng thì độ bền càng kém, tác động của một số ion kim loại trong dịch với nồng độ khoảng 10-3M như Ca++ làm tăng tính bền.